“高質量測序技術”高通量測序技術又稱“下一代”測序技術，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。因其高通量、不依賴于已知核酸序列和具有更高的靈敏度，從最初未知β屬冠狀病毒的快速鑒定到病毒序列的完整破譯，再到病毒序列的變異監測，高通量測序技術在疫情防控工作中發揮了非常重要的作用。
大咖簡介
歐陽能太教授
現任中山大學孫逸仙紀念醫院病理科副研究員，細胞分子診斷中心副主任，于中山醫科大學取得醫學本科和病理碩士學位，德國慕尼黑科技大學取得醫學博士學位，在紐約醫學院和紐約州立大學完成博士后訓練；曾分別任廣州醫學院附一院病理醫師、Texas A&M University毒理與腫瘤實驗室Scientist和紐約州立大學腫瘤預防研究所副教授；主要研究方向為腫瘤病理曾獲多項美國NIH研究基金。發表SCI論文50多篇以及Elsevier和Springer出版社Book Chapter多篇
NGS實驗室建設原則有哪些？
歐陽能太教授：
NGS技術是精準醫學領域中一項非常關鍵的技術。精準診斷離不開分子診斷，而NGS技術是其中最難亦是應用最廣的一項分子診斷技術。NGS技術相對比較復雜，需要一整套的系統工程才能完成，其中NGS實驗室的建設非常關鍵，也容易出現問題。
NGS實驗室的建設原則可參考我們這一領域的大咖李金明教授提出的一個原則，其稱之為“16字方針”，即各區獨立、注意風向、因地制宜、方便工作。前兩個原則涉及如何設置，后兩個原則則提醒注意不要走過頭，應根據醫院的實際情況，注意工作的方便，不拘泥于標準。
我提醒大家需要特別注意第一點“各區獨立”。目前各個醫院對NGS技術的支持力度很大，但在建設NGS實驗室時需注意總體面積不宜過大，以免能耗消耗非常大。此外，在實驗室各區比例的設置上不要求平均比例，有的環節很小即可，有的環節可相對較大一些，即比例要合適。隨著醫院對NGS實驗室的支持力度越大，要求也越為嚴格，但有些醫院也出現走極端的情況，即分區非常多，房間數很多，但實際并不方便工作。應注意類似步驟的合并，設置適當的房間數。
第二點，需注意風向。其一，NGS實驗室應使用全新風系統，而不能使用普通家用空調。新風系統可排出污染，而這是防污染最基礎的設置。其二，需注意整個房間的氣流方向應形成對流才有效。
其三，目前出現問題較大的是生物安全柜、通風柜和超凈工作臺這三種設備的合理配置使用。對于樣本的處理，需使用生物安全柜。生物安全柜通常使用A2級，不要太高級，30%外排即可滿足基本需求。B2級過高，100%外排，其實并不是很合適。超凈工作臺除了在試劑準備間中可以使用外，其他地方不適宜使用。在所有環節中均使用超凈工作臺是不對的，因為超凈工作臺沒有外排功能，如果DNA氣溶膠一直在室內循環是不合適的。而有的單位為了重視起見，所有環節，包括文庫構建都使用生物安全柜，實際上也沒有必要。除了樣本處理間，其他地方使用通風柜即可。相關注意事項很多，在此不一一贅述。
NGS質量控制三大要點是？
歐陽能太教授：
NGS技術是一項系統工程，質量控制非常重要，主要的質控點有三個，具體如下：
質控點1
腫瘤樣本的質控
第一個便是腫瘤樣本的質控。在實際工作中有時會出現搞錯樣本的情況，或是前期診斷的失誤等。例如，對肺腺癌進行EGFR檢測，但如果拿到的是小細胞肺癌的樣本，則通常不做。其次，對樣本中癌細胞的數量要進行質控。細胞數量太少，可能無法測出。雖說NGS靈敏度比較高，但仍有檢測下限。而癌細胞占比也很重要，如果癌細胞占比很小，而其他細胞占比很大，也會影響檢測靈敏度，此時需要進行富集。概而言之，即在腫瘤樣本的質控上需注意腫瘤類型、癌細胞總體數量和占比。
質控點2
文庫構建
第二個質控點是文庫構建。文庫構建是一個中間環節，即上機之前樣本是否準備妥當。主要涉及濃度和片段大小是否符合要求。濃度，一般使用Qubit測濃度即可；片段大小，通常用Agilent 2100做質控。
質控點3
數據
第三個質控點是數據，即測序后下機的數據是否符合要求。因為前兩個步驟可能沒有發現問題，但最后測序卻不行。這其中涉及很多方面，包括測序儀本身運行是否正常等。數據質控是最后一個質控點，如果上述均無問題，則可進行后續的臨床分析和解讀。
歐陽能太教授：NGS技術非常強大，也是一項非常好的技術，其應用于臨床也才剛剛起步，目前還有很多大醫院都沒有開展。我相信在未來NGS技術的應用不論是使用的范圍，還是使用的深度都將有很大的發展。
NGS實驗室如何分區？
高通量測序（NGS）實驗室
目前高通量測序技術在臨床檢測上的應用越來越廣泛，今天給大家簡單介紹一下NGS實驗室的建設和合理分區。
一、什么是高通量測序（NGS）技術？
高通量測序技術又稱NGS (Next Generation Sequencing) 技術，它是對傳統Sanger測序技術（即一代測序技術）進行了革命性的升級，可同時對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定，使得轉錄組學和基因組學被廣泛應用于臨床疾病診療實踐中，預示著疾病診療分子時代的到來。
二、什么是高通量測序（NGS）實驗室？
高通量測序檢測實驗室也叫NGS實驗室，是以高通量測序技術為檢測手段，來完成臨床疾病篩查、診斷或輔助診斷、腫瘤基因突變檢測等項目。高通量測序實驗包括濕桌實驗過程和干桌實驗過程，其中濕桌實驗是指實驗標本預處理、核酸提取及其片段化、建庫、擴增、靶序列富集、混樣、測序前準備及測序，干桌實驗是指測序后的數據分析、對比、注釋和結果報告等生物信息學分析流程。
由于NGS技術對所檢測的核酸模板進行大量擴增，容易出現實驗室污染導致檢測結果不準確；且NGS實驗要求高、影響因素多，實驗過程處理不當也會導致檢測結果異常。因此一個嚴格有序、規范的NGS實驗室是非常必要的。
三、NGS實驗室設計原則有哪些？
1、各區獨立
實驗室各個區域無論是在物理空間上還是實際使用過程中，都應當處于完全分隔狀態，并且各區域之間不能有空氣的直接流通。
2、單一流向
NGS檢測通常涉及PCR擴增及核酸純化富集等過程，任何樣本源性污染、分析標簽源性污染、擴增產物污染或氣溶膠污染均可能導致假陽性或假陰性結果出現，因此各實驗區域與緩沖間應有一定的通風壓力差，保證合理的空氣流向，防止污染。
3、因地制宜
新建實驗室除合理規范外，也要易于管理；若原有實驗室通過合理的規劃改造也能滿足質量管理要求，亦可不必特地新建實驗室。
4、方便工作
實驗室區域選擇及空間設計還應最大限度考慮是否方便日常監測工作，包括方便人員流動效率、大型儀器設備進出落地等。
四、NGS實驗室如何分區？
NGS實驗室分區示意圖
（引自李金明. 高通量測序技術）
1、試劑準備區
本區域為潔凈區域，用于試劑的配制、分裝及少量儲藏等，需存放于此區域的試劑不可逆行由后續處理樣本的區域進入。另外，試劑盒中的陽性質控品和對照品不應貯存于此區域。
儀器設備：冰箱、生物安全柜、純水儀、渦旋振蕩器、移液器和離心機。
2、樣本準備區
本區域為半污染區，用于核酸的提取及濃度測定。在提取不同類型的樣本（新鮮組織、FFPE、血液等）核酸時應避免樣本之間的交叉污染，建議在區域內設置不同樣本的獨立的超凈工作臺。布局時應注意高速離心機運行時產生的振動是否干擾其它設備等細節。
儀器設備：冰箱、生物安全柜、核酸自動提取儀、高速離心機、水浴鍋、恒溫金屬浴、核酸定量儀、冰箱、移液器、渦旋振蕩器和磁力架。
3、文庫制備區
本區域為半污染區，用于文庫的構建。NGS檢測時常見的文庫制備方法有雜交捕獲法和擴增子法，兩種方法均包含通過PCR放大文庫產量的步驟，因此在文庫制備區構建文庫時，建議文庫擴增產物傳遞至下一階段區域（雜交捕獲區）進行純化及后續操作。另外，組織樣本進行捕獲法建庫時需要先對樣本做片段化處理，因此操作臺面規劃時應區分片段化區域和建庫區域。
儀器設備：冰箱、生物安全柜、普通PCR儀、核酸定量儀、磁力架、超聲打斷儀、移液器、渦旋振蕩器和離心機。
4、雜交捕獲區
本區域為半污染區，用于文庫擴增后的純化，以及后續的二次擴增或捕獲富集等步驟。嚴防此區域擴增產物及氣溶膠等對其它區域的污染，盡量減少人員在該區域與其它區域之間反復頻繁流動，同時該區域的實驗物品、實驗服等盡量避免外帶。
儀器設備：普通PCR儀、核酸定量儀、磁力架、金屬浴、真空濃縮儀、移液器、渦旋振蕩器和微型離心機。
5、文庫擴增區
本區域為半污染區，對雜交捕獲產物進行PCR擴增富集，同時對上機測序前的文庫進行質控，并且完成文庫上機前文庫最終的稀釋和混樣。
儀器設備：冰箱、普通PCR儀、核酸定量儀、磁力架、移液器、渦旋振蕩器和微型離心機。
6、測序分析區
本區域為半污染區，用于文庫的上機測序。此區域應配備穩定的供電設施及備用電源，并配備獨立的制冷設施保證測序儀在相對恒定的溫濕度環境下工作；還需開設適宜面積的機房用于放置服務器等，所配備的網關設備應兼具穩定性和安全性，確保數據有效、安全傳輸。
儀器設備：測序儀、服務器、穩定電源。
7、電泳區
本區域為半污染區，用于核酸樣本質量和文庫片段的分析。
儀器設備：冰箱、凝膠電泳、生物片段分析儀、移液器、渦旋振蕩器和微型離心機。
總之，一個規范的NGS檢測實驗室是獲得準確檢測結果的重要保障，在實驗室運行過程中要始終堅持“工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時”的基本準則。
